【摘要】目的：構(gòu)建大鼠白細(xì)胞介素12(rIL-12)基因真核表達(dá)載體質(zhì)粒，建立rIL-12基因修飾并穩(wěn)定表達(dá)的大鼠膠質(zhì)瘤9L/rIL-12細(xì)胞。方法：用Trizol提取大鼠腹腔巨噬細(xì)胞總RNA，RT-PCR方法分別獲取rp40和rp35cDNA，依次克隆入pcDNA3.1(-)/myc-HisA質(zhì)粒中，以IRES連接雙亞基，構(gòu)建成雙順反子真核表達(dá)載體質(zhì)粒pcDNA3.1/rIL-12。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠膠質(zhì)瘤9L細(xì)胞，G418篩選單克隆細(xì)胞株，ELISA法檢測其培養(yǎng)上清rIL-12(p70)蛋白含量，同時(shí)抽提細(xì)胞RNA，RT-PCR方法檢測rp40、rp35基因在9L/rIL-12細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果：所得rp40cDNA序列與GeneBankNM022611及AF133197、rp35cDNA序列與GeneBankNM053390及AF177031均一致，構(gòu)建的質(zhì)粒經(jīng)PCR、酶切及測序鑒定正確。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染9L細(xì)胞后，獲得2個(gè)rIL-12基因穩(wěn)定、高效表達(dá)的9L/rIL-12單克隆細(xì)胞株，其培養(yǎng)上清rIL-12(p70)蛋白含量分別為139.0、162.1pg/ml，RT-PCR結(jié)果顯示細(xì)胞中rIL-12基因表達(dá)呈陽性。結(jié)論：成功構(gòu)建了rIL-12真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/rIL-12，并建立了9L/rIL-12細(xì)胞株，為rIL-12基因修飾的膠質(zhì)瘤疫苗研究打下了基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】大鼠 白細(xì)胞介素12質(zhì)粒 神經(jīng)膠質(zhì)瘤 9L細(xì)胞

免疫療法被視為有前景的膠質(zhì)瘤治療新模式。利用免疫細(xì)胞因子及基因治療可以增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤的免疫反應(yīng)，其中白細(xì)胞介素12(IL-12)以其廣泛的生物學(xué)效應(yīng)、強(qiáng)大的抗腫瘤作用，被譽(yù)為最有效的抗腫瘤細(xì)胞因子之一^①②。

本研究利用脂多糖(LPS)刺激體外培養(yǎng)的大鼠腹腔巨噬細(xì)胞，提取細(xì)胞RNA，RT-PCR擴(kuò)增出大鼠IL-12(rIL-12)的rp40及rp35cDNA，將之依次亞克隆至pcDNA3.1(-)/myc-HisA質(zhì)粒中，并用脊髓灰質(zhì)炎病毒的內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internalribosomeentrysite，IRES)進(jìn)行連接，構(gòu)建成rp40及rp35兩亞基的雙順反子真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/rIL-12，應(yīng)用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠膠質(zhì)瘤9L細(xì)胞，建立rIL-12基因穩(wěn)定表達(dá)的9L/rIL-12細(xì)胞株。

1、材料與方法

1.1  細(xì)菌、質(zhì)粒與細(xì)胞大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH-5α為Tiangen產(chǎn)品。pcDNA3.1(-)/myc-HisA/IRES質(zhì)粒由英國格拉斯哥大學(xué)免疫和細(xì)菌學(xué)室XiaoqingWei博士惠贈。野生型大鼠膠質(zhì)瘤9L細(xì)胞株由美國洛杉磯加州大學(xué)神經(jīng)外科LindaMLiau博士惠贈。

1.2 實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物雄性Wistar大鼠購于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(粵檢證字2002A041)，5~6周齡，體質(zhì)量(250±50)g，由廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心按清潔級動(dòng)物飼養(yǎng)。

1.3 主要試劑 LPS為Sigma產(chǎn)品，Trizol、G418、LipofectamineTM2000為Invitrogen產(chǎn)品，各種限制性內(nèi)切酶、高保真PyrobestTaq酶、T4DNA連接酶為TaKaRa產(chǎn)品，反轉(zhuǎn)錄試劑盒為Promega產(chǎn)品，凝膠回收試劑盒為U-gene產(chǎn)品，質(zhì)粒提取試劑盒為Tiangen產(chǎn)品，大鼠IL-12(p70)ELISA試劑盒為Biosource產(chǎn)品，DMEM、胎牛血清(FBS)均為Gibco產(chǎn)品。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成 參照GeneBank中rIL-12的cDNA序列，利用VectorNTIAdvance10軟件設(shè)計(jì)rp40和rp35的PCR引物，rp40上游引物5'端加上XhoⅠ(CTCGAG)酶切位點(diǎn)，下游引物5'端加上NotⅠ(GCGGCCGC)酶切位點(diǎn)，rp35上游及下游引物5'端均加上EcoRⅠ(GAATTC)酶切位點(diǎn)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因?yàn)镽T-PCR內(nèi)參，長度為252bp(表1)。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.5 大鼠腹腔巨噬細(xì)胞的制備及IL-12基因的克隆 參照文獻(xiàn)^③提取Wistar大鼠腹腔巨噬細(xì)胞，加入10μg/mlLPS培養(yǎng)12～24h，收集細(xì)胞，Trizol提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，分別用rp40、rp35引物PCR擴(kuò)增rp40、rp35基因片段;反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃5min，94℃45s、63℃45s、72℃45s循環(huán)30次，延伸72℃5min，4℃保持。1%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，紫外燈下切割目標(biāo)基因條帶，凝膠回收基因片段。分別以XhoⅠ、NotⅠ雙酶切rp40基因片段，EcoRⅠ單酶切rp35基因片段，酶切產(chǎn)物電泳分離，再次凝膠回收、純化，獲得可以用于亞克隆的兩基因片段。

1.6 重組質(zhì)粒pcDNA3.1/rIL-12的構(gòu)建及鑒定 具體方法參照文獻(xiàn)^④，分兩步構(gòu)建：首先以XhoⅠ、NotⅠ雙酶切載體質(zhì)粒pcDNA3.1(-)/myc-HisA-IRES，回收線性化的載體片段并與rp40基因片段連接，構(gòu)建中間質(zhì)粒pcDNA3.1/rp40-IRES。然后以EcoRⅠ單酶切質(zhì)粒pcDNA3.1/rp40-IRES，回收線性化的載體片段，再與rp35基因片段連接構(gòu)建pcDNA3.1/rp40-IRES-rp35(即重組質(zhì)粒pcDNA3.1/rIL-12)。以重組質(zhì)粒為模板，PCR鑒定rp40、rp35基因的表達(dá)。分別用EcoRⅠ單酶切、XbaⅠ單酶切、XbaⅠ和NotⅠ雙酶切重組質(zhì)粒，并利用VectorNTIAdvance10軟件預(yù)測酶切結(jié)果。質(zhì)粒DNA測序由大連寶生物工程有限公司完成，以測序結(jié)果鑒定rp35基因插入方向正確與否。構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)鑒定正確后，大提質(zhì)粒備用。

1.7 質(zhì)粒pcDNA3.1/rIL-12轉(zhuǎn)染9L細(xì)胞9L細(xì)胞的培養(yǎng)參照文獻(xiàn)^⑤。重組質(zhì)粒采用脂質(zhì)體介導(dǎo)方法和電穿孔方法轉(zhuǎn)染野生型9L細(xì)胞。脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染方法按LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行。電穿孔方法按GenepulserXcellTMelectroperationSystem(BioRad產(chǎn)品)操作指南進(jìn)行，參數(shù)為方波、300V、20ms。

1.89 L/rIL-12單克隆細(xì)胞株的建立及rIL-12的表達(dá) 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染9L細(xì)胞后，G418(終濃度600μg/ml)篩選7～14d，采用有限稀釋法和畫圈法挑取單克隆細(xì)胞株培養(yǎng)、擴(kuò)增、傳代。將篩選的單克隆細(xì)胞株各代細(xì)胞分別取5×106細(xì)胞數(shù)，用10ml含G418的DMEM完全培養(yǎng)液定量培養(yǎng)72h，取上清，按Biosource試劑盒說明書，采用ELISA方法檢測rIL-12(p70)濃度;同時(shí)用Trizol抽提細(xì)胞的總RNA，RT-PCR檢測細(xì)胞中rp40、rp35基因的表達(dá)。

2、結(jié)果

2.1 rIL-12基因克隆及重組質(zhì)粒構(gòu)建 經(jīng)LPS刺激的大鼠腹腔巨噬細(xì)胞提取的RNA經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出rp40及rp35cDNA片段，大小分別約為1008bp和647bp，酶切純化后依次亞克隆入載體質(zhì)粒pcDNA3.1(-)/myc-HisA-IRES相應(yīng)的位點(diǎn)，構(gòu)建成rp40和rp35兩亞基雙順反子真核表達(dá)的重組質(zhì)粒pcDNA3.1/rIL-12。

2.2 重組質(zhì)粒鑒定 以重組質(zhì)粒為模板行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物電泳顯示rp40和rp35條帶清晰。質(zhì)粒酶切鑒定，電泳條帶與預(yù)測吻合，其中EcoRⅠ單酶切可將插入的rp35基因切下;rp40基因中存在1個(gè)XbaⅠ酶切位點(diǎn)，XbaⅠ單酶切質(zhì)粒出現(xiàn)3條帶;XbaⅠ和NotⅠ雙酶切因緩沖體系不同僅出現(xiàn)2條帶。重組質(zhì)粒測序結(jié)果與GeneBank比對，rp40cDNA序列與NM022611及AF133197、rp35cDNA序列與NM053390及AF177031均一致，rp35基因插入載體質(zhì)粒方向正確。

2.3 9L/rIL-12細(xì)胞的建立及rIL-12基因表達(dá) 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染野生型大鼠9L細(xì)胞后，共獲得12個(gè)9L/rIL-12單克隆細(xì)胞株，其中第2、7號單克隆細(xì)胞株傳至第5代，以5.0×106細(xì)胞數(shù)/10ml定量培養(yǎng)72h，ELISA檢測培養(yǎng)上清中rIL-12(p70)蛋白濃度分別為139.0、162.1pg/ml。Trizol抽提2、7號克隆株第5代細(xì)胞總RNA，RT-PCR結(jié)果顯示rp35和rp40基因表達(dá)均為陽性。

3、討論

IL-12最早稱為自然殺傷細(xì)胞刺激因子(NKCSF)^⑥或細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞成熟因子(CLMF)^⑦。IL-12具有廣泛的生物學(xué)活性，主要有以下功能：①促進(jìn)T細(xì)胞及NK細(xì)胞增殖，并通過促進(jìn)分泌IFNγ而增強(qiáng)其殺傷活性;②促進(jìn)Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng);③促進(jìn)多種黏附分子和MHC分子的表達(dá)，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性;④抑制瘤體內(nèi)新生血管形成，從而抑制腫瘤生長;⑤促進(jìn)一氧化氮生成，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡;⑥特別具有對抗TGF-β、PGE-2、IL-10、IGF-Ⅰ等膠質(zhì)瘤分泌的免疫抑制細(xì)胞因子作用，從而有助于改善腫瘤局部免疫抑制狀態(tài)的微環(huán)境。IL-12是最有效的抗腫瘤細(xì)胞因子之一，是連接體內(nèi)天然免疫與特異性免疫的橋梁^①②。

IL-12主要由抗原提呈細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等以“旁分泌”的形式在局部發(fā)揮作用。全身給藥時(shí)，不僅腫瘤局部IL-12濃度難以達(dá)到抗腫瘤的要求，而且大劑量的反復(fù)應(yīng)用可引起嚴(yán)重副反應(yīng)，在腦瘤治療中可引起嚴(yán)重腦水腫。將IL-12基因轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞后再用于體內(nèi)，通過細(xì)胞表達(dá)，IL-12以旁分泌的形式在局部發(fā)揮作用，副反應(yīng)小，更符合其在體內(nèi)作用的生理模式^⑧。

IL-12是由二硫鍵連接兩亞基的異二聚體，兩亞基相對分子質(zhì)量為35ku和40ku，由位于不同染色體上的基因p35和p40編碼，其中p35亞基決定IL-12的種屬特性，而p40亞基包含與IL-12受體結(jié)合的必需基團(tuán)，且其前端包含促進(jìn)IL-12分泌至細(xì)胞外的信號肽。p40單體或同二聚體可與IL-12競爭結(jié)合受體而強(qiáng)烈拮抗IL-12的生物學(xué)活性，在轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，只有兩亞基在體內(nèi)等量表達(dá)并正確折疊，才能形成有生物學(xué)活性的IL-12^⑥⑦。因此，采用其進(jìn)行基因治療前，必須構(gòu)建兩亞基等量共表達(dá)的載體^⑨。目前國內(nèi)外學(xué)者多采用IRES連接p40和p35的方法構(gòu)建雙亞基共表達(dá)的載體，通過IRES在翻譯過程中的內(nèi)啟動(dòng)作用實(shí)現(xiàn)同一轉(zhuǎn)錄水平上的等量表達(dá)。

國內(nèi)已經(jīng)有成功克隆小鼠IL-12基因的報(bào)道^⑩，但大鼠IL-12基因克隆尚未見文獻(xiàn)報(bào)告。本研究通過提取大鼠腹腔巨噬細(xì)胞總RNA，RT-PCR擴(kuò)增出rIL-12的rp40及rp35cDNA，將其依次克隆至pcDNA3.1(-)/myc-HisA質(zhì)粒中，并用IRES連接，構(gòu)建成同時(shí)含rIL-12rp40及rp35兩亞基的雙順反子真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/rIL-12。將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞9L，獲得rIL-12基因穩(wěn)定表達(dá)的9L/rIL-12單克隆細(xì)胞株，其培養(yǎng)上清經(jīng)ELISA檢測，rIL-12(p70)蛋白分泌量達(dá)139.0、162.1pg/ml。大鼠IL-12雙順反子真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/rIL-12的成功構(gòu)建及9L/rIL-12細(xì)胞株的建立，為IL-12基因修飾的大鼠膠質(zhì)瘤疫苗研究打下了基礎(chǔ)。

【參考文獻(xiàn)】

[1] COLOMBO M P, TRINCHIERI G. Interleukin-12 in anti-tumor immunity and immunotherapy [J]. Cytokine Growth Factor Rev, 2002, 13(2): 155-168.

[2] PORTIELJE J E, GRATAMA J W, VAN OJIK H H, et al. IL-12: a promising adjuvant for cancer vaccination [J]. Cancer Immunol Immunother, 2003, 52(3): 133-144.

[3] SHIRATORI I, MATSUOTO M, TSUJI S, et al. Molecular cloning and functional characterization of guinea pig IL-12 [J]. Int Immunol, 2001, 13(9): 1129-1139.

[4] 薩姆布魯克 J, 拉塞爾 D W. 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南 [M]. 黃培堂, 譯. 3版. 北京: 科學(xué)出版社, 2002: 1230-1232.

[5] 林健, 王偉民, 冼江, 等. 9L/F344大鼠腦膠質(zhì)瘤模型的建立 [J]. 中國微侵襲神經(jīng)外科雜志, 2003, 8(8): 359-362.

[6] KOBAYASHI M, FITZ L, RYAN M, et al. Identification and purification of natural killer cell stimulatory factor (NKSF), a cytokine with multiple biological effects on human lymphocytes [J]. J Exp Med, 1989, 170(3): 827-845.

[7] STERN A S, PODLASKI F J, HULMES J D, et al. Purification to homogeneity and partial characterization of cytotoxic lymphocyte maturation factor from human B-lymphoblastoid cells [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1990, 87(17): 6808- 6812.

[8] DIMECO F, RHINES L D, HANES J, et al. Paracrine delivery of IL-12 against intracranial 9L gliosarcoma in rats [J]. J Neurosurg, 2000, 92(3): 419-427.

[9] CHEN L, CHEN D, BLOCK E, et al. Eradication of murine bladder carcinoma by intratumor injection of a bicistronic adenoviral vector carrying cDNAs for the IL-12 heterodimer and its inhibition by the IL-12 p40 subunit homodimer [J]. J Immunol, 1997, 159(1): 351-359.