【摘要】目的:初步研究非綜合征性唇腭裂患者可能存在的代謝機制，同時探討基于核磁共振(NMR)的代謝組學技術在臨床應用中的可行性。方法:分別收集10例非綜合征性唇腭裂患者和10例正常人的血漿，在核磁共振儀上對血漿樣本進行采樣，獲得一系列原始的一維NMR譜圖，然后使用MESTRE-v4.7軟件對NMR譜圖進行積分簡化數據，將譜圖分解成212個區域進行積分，得到積分強度，利用SIMCA-P11.0軟件對積分強度進行主成分分析。結果:非綜合征性唇腭裂患者和正常人的血漿代謝存在差異，至少存在3種不同的代謝產物，分別為三羥丁酸γ甲基類物質、精氨酸和纈氨酸。非綜合征性唇腭裂患者血漿代謝產物以纈氨酸和三羥丁酸γ甲基類物質為主，而正常人血漿代謝產物則以精氨酸為主。結論:通過代謝組學技術，可以初步探討非綜合征性唇腭裂患者的代謝機制，同時該技術有望應用于臨床。

【關鍵詞】代謝組學;非綜合征性唇腭裂;主成分分析

非綜合征性唇腭裂是口腔頜面部最常見的先天性發育畸形，占整個頜面部面裂畸形的70%以上。該病發病因素復雜，對其病因學的研究意義重大。若能明確其發病原因，并采取有效的干預措施，有望從根本上預防該疾病的發生。目前，對唇腭裂的病因學研究取得了一定的進展，如發現唇腭裂是多因素遺傳疾病，與孕期吸煙、用藥等因素有關等^①③，但其確切的代謝機制和發病原因尚不清楚。本文通過研究非綜合征性唇腭裂患者血漿的代謝機制，推斷其潛在的發病原因，同時探討基于核磁共振(nu-clearmagneticresonance，NMR)的代謝組學在臨床應用中的可行性。

1、材料和方法

1.1 試驗儀器

本試驗使用的主要儀器有：BrukerAvanceDRX600核磁共振儀(Bruker公司，德國);XYJ80-2低速離心機(江蘇金壇實驗儀器有限公司);MR1812高速離心機(Jouan公司，法國);4mL肝素鈉抗凝管(BectonDickinson公司，美國);FD-1冷凍干燥機(北京博康實驗儀器有限公司)。

1.2 研究對象的選擇

隨機選擇2004—2005年在四川大學華西口腔醫院唇腭裂外科行手術治療的非綜合征性唇腭裂患者10例作為病例組，其中單純性腭裂患者6例，唇裂并發腭裂患者4例;女性8例，男性2例;年齡6～19歲，平均年齡(12.6±6.5)歲。同時隨機選擇2004—2005年在四川大學華西醫學中心婦幼保健院查體的健康人10例作為對照組，女性8例，男性2例;年齡7～20歲，平均年齡(13.0±5.1)歲。病例組納入標準：診斷為非綜合征性唇腭裂的患者，無其他系統性疾病。排除標準：1)患有綜合征性唇腭裂如Shprintzen綜合征或Robbin綜合征者;2)患有先天性代謝缺陷

如楓糖尿癥患者;3)臨床生化結果異常者，或者患有血液系統疾病者;4)傳染病患者如獲得性免疫缺陷綜合征、B或C型肝炎等^④⑤。

1.3 研究方法

1.3.1 樣本采集及處理 樣本采集前，2組研究對象要求空腹6h。樣本采集于上午9時左右在室溫下進行。抽取研究對象靜脈血液4mL，緩慢注入4mL肝素鈉抗凝管中，室溫下1500r/min低速離心10min，以去除全血中血細胞等大分子物質。離心后用移液槍吸取上清液(即血漿)2mL放入EP管內，進行二次離心(4℃下20000r/min離心10min)，以去除血漿中的雜質，保留血漿中的小分子代謝物質。離心后吸取上清液1.8mL放入干凈的EP管內，將樣本進行凍干處理，然后保存在-20℃低溫冰箱中備用。

1.3.2 NMR數據的采集 將凍干處理過的血漿樣本在室溫下解凍，將450μL解凍樣本移入干凈的核磁管內，以體積比1∶10的比例緩慢加入重水至500μL，混勻，靜置5min。每個樣本制備完成后直接在核磁共振儀上進行光譜采集，獲得原始的一維氫譜。光譜采集在室溫下進行，采樣點數是32k，累加次數128次，核磁共振儀實際工作頻率為600.13MHz。掃描對水峰進行抑制的原始一維氫譜，可以獲得

131072個數據點，其峰寬度為7788.16Hz，最小頻率為-1073.15Hz。掃描未進行水峰抑制的氫譜同樣可獲得131072個數據點，其峰寬度為7183.91Hz,最小頻率為-651.29Hz。

1.3.3 NMR數據后加工過程和化學計量分析方法 所有樣本的自由感應衰減(freeinductiondecay，FID)信號導入MESTRE-v4.7軟件進行傅里葉轉換(Fouriertransform，FT)，獲得一維NMR譜圖，將所獲得的譜圖進行基線調整。由于δ4.52～6.00含有水峰^⑥⑦，該區域的化學位移被排除在外。將各個樣本的氫譜δ0～4.52及δ6～10按bin0.04為單位進行分割，得到212個化學位移值段，進一步按各化學位移值段分別積分，即得到與各個化學位移值段相對應的積分值，這樣就簡化了原始數據(圖1)。對每個樣本進行光譜采集，可獲得20組數據，構成1個n×d二維矩陣(其中n為樣本組數，d為積分區間數)，這樣更具有統計學意義。將數據導入Excel文件中備用。使用SIMCA-P11.0軟件對該二維矩陣進行化學計量處理，主要進行主成分分析(principalcompo-nentanalysis，PCA)。

2、結果

本研究中所建立的新變量模型含有9個主成分(principalcomponent，PC)，前2個主成分(PC1和PC2)的累積貢獻率為93.5%，說明所建立的變量具有很好的預測性。前2個主成分的PC圖見圖2。由圖2可以看出，對照組樣本間變異較大，病例組樣本間則具有高度相似性，但這2個主成分不能完全區分2組的樣本。第2和第3個主成分(PC2和PC3)的PC圖見圖3，這2個主成分可以區分病例組和對照組，因此筆者選用PC2和PC3作為研究對象。圖4為PC2和PC3的因子負荷圖，可見圖中大多數點集中于原點，表現為重疊點，即具有相同的代謝產物，也就是說病例組和對照組具有相同的代謝產物;但是有少數的點遠離原點，這些點所代表的化合物造成了某些樣本間血漿代謝物的差異，主要表現為氨基酸及脂類物質的異常代謝。對這些異常代謝物作進一步分析，引起這種差異的代謝物的NMR峰主要集中在δ1.20、δ1.80、δ3.60(圖4)。對發生變化的NMR譜峰進行分析，這些化學位移值分別代表一些氨基酸及脂類物質，如精氨酸、纈氨酸和三羥丁酸γ甲基類物質等^⑥⑧。對照組血漿代謝產物中以精氨酸為主，而病例組血漿代謝產物則含有三羥丁酸γ甲基類物質和纈氨酸。

3、討論

先天性唇腭裂危害著口腔頜面器官的形態及功能，嚴重影響了出生人口素質及母嬰身心健康。從遺傳學上，該疾病可分為綜合征性唇腭裂與非綜合征性唇腭裂，其中非綜合征性唇腭裂最為多見。非綜合征性唇腭裂是一個復雜的、由遺傳和環境因素相互作用所致的疾病，其代謝產物可能會出現異常表達。本研究運用代謝組學對10例非綜合征性唇腭裂患者和10例正常人進行分析，初步了解非綜合征性唇腭裂患者的代謝機制。結果發現，非綜合征性唇腭裂患者和正常人在血漿代謝產物上存在差異，其差異主要表現在某些氨基酸的異常代謝上，如精氨酸和纈氨酸。正常人血漿代謝產物中以精氨酸為主，而非綜合征性唇腭裂患者血漿代謝產物則含有三羥丁酸γ甲基類物質和纈氨酸。精氨酸是鳥氨酸循環中的重要組成成分，具有極其重要的生理功能，在嬰幼兒發育中起著重要的作用，若缺乏則不能維持嬰幼兒正常的生長與發育。纈氨酸為必需氨基酸，作用于黃體、乳腺及卵巢，其功能主要是維持神經系統功能正常。三羥丁酸γ甲基類物質在血漿中表現為低密度脂蛋白，在某些腫瘤患者血漿中表現為高表達的巖藻糖甲基脂蛋白。

本研究結果提示，運用代謝組學技術可以早期篩查某種疾病并探討其代謝機制，也說明在此基礎上推斷其潛在的發病原因是可行的。但本研究僅僅在技術方法上進行了一些探索，得出了部分有意義的結果，在下一步工作中，筆者擬從兩方面進行深入的研究：一方面嚴格控制受試者的飲食，主要是禁止食用含有魚肉和櫻桃等食品，因為代謝組學容易受到飲食習慣、生活方式和文化差異等因素的影響;另一方面應擴大樣本含量，使其更具有統計學意義。研究生物體液最有效和全面的方法是對其基因、蛋白質表達水平和代謝濃度同時進行監測。如何把代謝組學數據和轉錄組學、蛋白質組學、遺傳學、酶學、代謝途徑和表現型分析的數據整合在一起，并給出生物學功能的解釋是很艱巨的任務。它們的整合除了需要適當的數據庫外，還需要多種先進的數學分析方法。隨著基因組學、蛋白質組學和代謝組學認識的不斷深入和研究工作的不斷積累，這些技術必將會越來越廣泛地應用于生物醫學研究之中。

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