【摘要】目的：研究牙周病患牙累及的牙根面經EDTA脫礦和富血小板血漿(PRP)單獨及聯合處理后對人牙周膜成纖維細胞附著、增殖的影響。方法：以因牙周病不能保留而拔除的患牙制備的牙根片為對照組，PRP和EDTA脫礦單獨及聯合處理患牙根片為實驗組，用細胞計數法及四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色實驗分析人牙周膜成纖維細胞在病變根面上的附著和增殖。結果：未處理組的根片上有少量的細胞附著;根片經PRP或EDTA脫礦單獨處理能明顯增加細胞的附著(P<0.05);二者聯合處理促附著效果明顯增強(P<0.01)。未處理組根片上生長的細胞隨時間延長數量反而下降;經PRP或EDTA單獨處理的根片上的細胞有少量的增殖(P>0.05);二者聯合處理細胞增殖明顯(P<0.05)。結論：EDTA根面脫礦和PRP能有效促進人牙周膜成纖維細胞在牙周病患牙根面上的附著和增殖。

【關鍵詞】富血小板血漿 牙周膜成纖維細胞;附著 增殖

牙周病患牙根面存在各種毒素已成共識，根面平整、脫礦處理可有效地去除病變根面上的內毒素、殘留致炎物質等玷污層，從而有利于細胞附著、生長，促進新附著的形成。枸櫞酸、四環素及各種生長因子等可用于根面處理，但臨床應用研究發現根面用pH值為1的枸櫞酸處理并無更多的新附著形成^①。富血小板血漿(platelet richplasma,PRP)含有豐富的生長因子，以轉化生長因子β(TGFβ)和血小板源性生長因子(plateletderivedgrowthfactor，PDGF)含量較高，能促進體外培養的牙周膜成纖維細胞和成骨細胞的增殖和膠原的形成^②，Lekovic等^③將PRP、牛骨粉聯合應用治療慢性牙周炎骨缺損患者，取得較好的效果，劉琪等^④研究表明經PRP處理的生物降解膜能明顯增強鼠牙周膜成纖維細胞的附著和增殖。但用EDTA和PRP處理牙周炎患牙的根面能否促進人牙周膜成纖維細胞(periodontalligamentfibroblast，PDLF)的附著和增殖，目前國內尚未見報道。本研究旨在觀察PDLF在EDTA脫礦和PRP單獨及聯合處理病變根面上的附著和增殖，為其在牙周治療中的應用提供實驗依據。

1、材料與方法

1.1 材料

選擇年齡在12～30歲因正畸或阻生拔出的患牙，X線顯示無根尖病變、無牙槽骨吸收且牙齦正常者做牙周膜成纖維細胞的培養;選擇因重度牙周病拔除的患牙制備牙根片。

1.2 方法

1.2.1 牙周膜成纖維細胞的培養收集附著在牙根面的牙周膜組織，將其剪成1mm×1mm大小,移入25mL的培養瓶內,加入少量的含20%小牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素、20mmol/LHepes的DMEM培養液,將培養瓶直立于37℃、5%CO2飽和濕度的孵箱內，4～8h后倒瓶，使培養液充分浸沒組織塊，3d換液1次，直至傳代，待細胞貼滿瓶底80%左右時即行傳代培養，取第5～8代細胞用于實驗。

1.2.2 牙周炎患牙牙根片的制備牙齒拔除前標記釉牙骨質界至牙周袋底的區域,即牙周病累及的根面區，拔除過程中注意不損傷根面，拔除后用生理鹽水沖洗，用刮治器刮凈附在根面上的物質，在冷水冷卻的條件下用金剛砂片將牙根磨成4mm×4mm大小、0.5mm厚(只磨除牙本質側，牙骨質側不磨)的根片，經高壓后置入DMEM培養液中浸泡48h后待用。

1.2. 3 PRP的制備^⑤取新鮮全血(已加入抗凝劑)經2次離心提取PRP，第1次1300r/min離心10min，吸取全部上清液及交界面以下1～2mm的紅細胞至另一離心管,棄去下層的紅細胞，再次2000r/min離心10min，下層為PRP，將PRP保存在-20℃冰箱待用，制作全過程嚴格無菌。

1.2.4 細胞計數實驗實驗分為脫礦組(24%的EDTA處理2min，DMEM沖洗3遍后自然干燥)和未脫礦組(將準備好的根片直接用于實驗)，脫礦和未脫礦的根片再分別用或不用PRP包被。將脫礦和未脫礦的根片用3mm×3mm的雙面膠固定在48孔板中，每組設3個樣本，放入超凈臺中紫外光照射2h，實驗組根片包被20μL的PRP,對照組不包被PRP，操作時保持無菌，取5～8代的牙周膜成纖維細胞，調整細胞濃度為3×104/mL,將細胞以每孔500μL接種于含根片的48孔板中，再于每孔中加入含2%FBS的DMEM培養液500μL，CO2孵箱內標準環境下培養24h。24h后取出48孔板，用小鑷子小心夾出根片放入另一塊有PBS液的48孔板中輕輕漂洗后放入一潔凈的96孔板中，每孔加入200μL的0.125g/L的胰蛋白酶消化5min，吸出消化液放入1.5mL的EP管中，將根片用不含FBS的DMEM培養液400μL反復沖洗3遍，沖洗液均收集于EP管中，將收集到根片上附著細胞的EP管以800～1000r/min離心5min，棄上清液，將收集到的細胞懸浮在200μL的培養液中，用血細胞計數板計數根片上所附著的細胞數，換算出每平方毫米根片上的細胞數。

1.2.5 四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色實驗根片固定和處理同細胞計數實驗，每孔接種細胞1.5×104個，分別于24h和48h后取出根片輕輕漂洗去除根面未附著的細胞，每孔加入200μL0.125g/L的胰蛋白酶消化5min，吸出消化液放入另一潔凈的48孔板中，將根片用不含血清的DMEN培養液反復沖洗3遍，沖洗液收集到一潔凈的48孔板中，每孔中加入MTT液20μL后將48孔板放入CO2孵箱內標準環境下孵育，4h后取出48孔板于每孔中加入150μL的二甲基亞砜不斷震蕩15min后放入ELX800酶聯免疫檢測儀中讀取光密度值。

1.3 統計學處理

采用SPSS11.0軟件對數據進行分析，計量資料的比較采用單因素方差分析(onewayanalysisofvariance,ANOVA)，檢驗水準a=0.05。

2、結果

2.1 細胞計數實驗結果

未處理組、單純脫礦組、單純PRP組、脫礦PRP組PDLF對病變根面的附著數分別為(251.74±15.03)、(312.50±26.04)、(347.22±30.07)、(485.96±29.81)細胞/mm2(24h)，單純脫礦組、單純PRP組、脫礦PRP組均明顯高于未處理組，差異有統計學意義(P<0.05～0.01)。

2.2 MTT實驗結果

未處理組牙周膜成纖維細胞48h的OD值明顯低于24h的OD值(P<0.05)，脫礦PRP組48h的OD值明顯高于24h的OD值(P<0.05)。不同處理組牙周膜成纖維細胞增殖的時間效應注：同組間與24h的OD值相比，P<0.05。

3、討論

用酸性藥物對根面平整后的病變根面進行脫礦處理是臨床牙周手術中常用的根面處理方法，用于根面處理的物質還有多種，如用四環素類藥物或各種生長因子(如TGFβ和PDGF)等處理根面，還有將釉基質蛋白用于臨床牙周手術中取得了再生的效果。研究表明用EDTA處理根面是一種有效的獲得牙周組織再生的方法^⑥。PRP因含多種生長因子,其促進牙周再生和修復的的作用日益受到學者們的重視,Kawase等^⑦研究表明來源于PRP的纖維蛋白能促進體外培養的牙周膜成纖維細胞和成骨細胞的膠原合成。本實驗中牙周病累及的病變根面未經處理，細胞的附著數較處理組明顯減少，且隨著時間的延長，細胞不但不增殖反而下降，經EDTA處理后再用PRP包被，牙周膜成纖維細胞的附著和增殖明顯增強，分析原因可能為既有EDTA去除了玷污層，中和了毒素，消除了殘留的毒素對細胞的抑制作用，同時又有PRP中生長因子的促增殖效應，可以推測PRP中的生物活性因子具有促牙周膜成纖維細胞附著和生長的潛能。關于PRP促進牙周再生的確切機制以及PRP在牙周治療中應用的可靠性仍需進一步研究。

【參考文獻】

1 孟煥新.牙周病學[M].第3版.北京：人民衛生出版社，2008.268.

2 Okuda K , Kanase T , Momose M , et al . Platelet rich plasma contains high levels of plateletderived growth factor and transforming growth factor beta and modulates the proliferation of periodontally related cells in vitro[J] .J Periodontal,2003 , 74(6) : 849857 .

3 Lekovic V , Camargo PM , Weinlaender M , et al . Comparison of plateletrich plasma , bovine porous bone mineral, and guided tissue regeneration versusplatelet rich plasma and bovine porous bone mineral in the treatment of intrabony defects : a reentry study[J]. J Periodontol,2002,73(2):198205 .

4 劉琪,Victor M, Mark B. 新型牙周再生細胞傳遞載體的體外建立[J].華西口腔醫學雜志,2006,22(1):1518.

5 Gonshor A.Technique for producing platelet rich plasma and platelet concentrate: background and process[J].Int J periodontics Restorative Dent, 2002,22(6):547557.

6 Sculean A, Donos N, Brecx M, et al. Treatment of intrabony defects with guided tissue regeneration and enamel matrix proteins. An experimental study in monkeys[J].J Clin Periodontol,2000 ,27(7):46672.

7 Kawase T, Okuda K, Wolff LF, et al. Platelet rich plasma derived fibrin clot formation stimulates collagen synthesis in periodontal ligament and osteoblastic cells in vitro[J]. J Periodontol,2003,74(6):85864.